Innocent NDM? De genetische achtergrond van een NDM positieve, meropenem gevoelige E. coli

Transcriptie

1 Innocent NDM? De genetische achtergrond van een NDM positieve, meropenem gevoelige E. coli Van Infectieziekten-Surveillance Naar Respons 28 mei, 2013, RIVM, Bilthoven Laura van Dommelen Stichting PAMM, Veldhoven en Marga van Santen Infectieziekteonderzoek, Diagnostiek en Screening (IDS) Centrum voor Infectieziektebestrijding (CIb) Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM)

2 Beta-lactam antibiotica Antibiotica voor behandeling van bacteriële infecties Eerste β-lactam antibiotica tegen Gram-positieve bacteriën Later breed spectrum β-lactam antibiotica ook tegen Grampositieve bacteriën β-lactam antibiotica remmen de celwand synthese Binding aan eiwit dat zorgt voor opbouw peptidoglycaanlaag Dit eiwit is DD-transpeptidase, een penicilline-bindend eiwit (PBP) 2

3 The never ending story: bacterium vs man Gebruik van antibiotica selecteert ongevoelige varianten Voor β-lactam antibiotica zijn er 2 mechanismen Bacterie vormt gewijzigd PBP waardoor antibioticum niet (goed) meer kan binden Bijv. Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) Bacterie vormt een enzym dat het β-lactam antibioticum afbreekt: β-lactamase Bijv. Carbapenem-resistente Escherichia coli 3

4 Werking van beta-lactamase β-lactam antibioticum (carbapenem) β-lactamase hydrolysis decarboxylation β-lactamase CO 2 4

5 Beta-lactams 5

6 Beta-lactam versus beta-lactamase Ontwikkeling van varianten van β-lactam antibiotica Redenen Breder spectrum, dus werkzaam tegen meer bacteriesoorten Resistentieontwikkeling Penicilline Penicillinase Breed-spectrum β-lactams (bijv. cephalosporines) Breed-spectrum β-lactamases Penicilline-G Extended spectrum β-lactams (bijv. 3 e generatie cephalosporines ) Extended spectrum β-lactamases (ESBL) Carbapenems Carbapenemases 6

7 Beta-lactamase genen in Gram-negatieven De meeste β-lactamase genen liggen op plasmiden Ze kunnen overdragen worden tussen bacteriën van hetzelfde species van verschillende species van verschillende genera Plasmiden bevatten vaak meerdere resistentiegenen: Overdracht kan multi-resistentie opleveren Er zijn allerlei genen die kunnen coderen voor carbapenemases: bla OXA, bla KPC, bla VIM, bla IMP, bla CMY, bla NDM etc. 7

8 Een bijzondere casus in Veldhoven Bij PAMM materiaal van patiënte met klinisch recidiverende urineweg infectie Fosfomycine helpt wel, maar daarna komen klachten snel weer terug. Vervolgens heeft ze ciprofloxacine gehad (november 2012) en recent gentamicine tijdens opname (april 2013). Ze krijgt een rash op nitrofurantoine. Kweek: in 2011 had ze nog een gewone E. coli in haar urinekweek. In oktober 2012 opnieuw kweek van E. coli in de Vitek. 8

9 Resistentiebepaling door PAMM Vitek resultaten E. coli is ESBL Verificatie met Checkpoints chip: NDM-1 positief! Vitek MIC voor meropenem zeer laag Bevestiging met e-test voor imipenem en meropenem: gevoelig! Wel bla NDM -gen, maar geen resistentie? bla NDM-1, New Dehli Metallo-β-lactamase Meestal buitenland anamnese 9

10 Contacten van patiënt Buitenland-contacten Echtgenoot van patiënt heeft een oud-ijzer bedrijf met veel medewerkers die vaak naar de Balkan reizen In 2012, 1 dag een Indiër op bezoek geweest Vlak voor afname kweek, in Turkije op vakantie geweest Met echtgenoot naar Dominicaanse Republiek, Mexico, Turkije en landen binnen Europa geweest Anders Komt dagelijks in woonwagenkamp (moeder woont daar) Heeft twee edel-papagaaien uit Nieuw Guinea 10

11 Onderzoek aan isolaat in het RIVM (BSR) Isolaat wordt in verdere verhaal Ec626 genoemd Confirmatie met NDM-specifieke PCR en e-test Inderdaad NDM-PCR+ en meropenem gevoelig Hypothese: het gen is beschadigd door mutaties Besloten om het hele bla NDM gen te sequencen: PCR met primers flankerend van het gen Sequentie bepalen van PCR product 11

12 Sequentie-analyse van het NDM gen Sequentie analyse toont aan dat het gaat om het bla NDM-5 gen Year Number of Nucleotide (amino acid) position reported reports (2013) 82 (28) 262 (88) 283 (95) 388 (130) 460 (154) 698 (233) bla NDM >330 C (Pro) G (Val) G (Asp) G (Asp) A (Met) C (Ala) bla NDM G (Ala) G G G A C bla NDM C G A (Asn) G A C bla NDM C G G G C (Leu) C bla NDM C T (Leu) G G C (Leu) C bla NDM C G G G A T (Val) bla NDM C G G A (Asn) C (Leu) C Het bla NDM-5 in Ec626 is helemaal intact, geen mutaties Zijn de codes voor expressie veranderd? Sequentie rondom NDM gen bepalen 12

13 Expressie van genen: transcriptie en translatie Gen in DNA Transcriptie mrna Translatie Eiwit Gencode in DNA overschrijven in mrna Gencode in mrna vertalen in eiwit 13

14 Transcriptie: gencode overschrijven in mrna Gen in DNA Transcriptie mrna RNA polymerase RNA polymerase mrna Gen RNA polymerase bindt op specifieke plaats, de Promotor Twee herkenningssequenties: -10 sequentie, consensus TATAAT -35 sequentie, consensus TTGACA 14

15 Translatie: gencode in mrna vertalen in eiwit mrna Translatie Eiwit ribo soom mrna ribo soom Eiwit Ribosoom bindt op specifieke plaats aan mrna De ribosoom bindingssequentie (RBS), consensus AGGAGG Het gen start met start codon meestal ATG, soms GTG of TTG 15

16 De promotor-regio van blandm ISAba RBS bla NDM TTTGAAACTGTCGCACCTCATGTTTGAattcgccccatatttttgctacagtgaaccaaattaagatca Dortet, Nordmann en Poirel 16

17 De promotor-regio van blandm (2) Normale NDM+ stam Ec626 17

18 Ontstaanswijze van de Ec626 Een normaal NDM cluster IS5 ISAba125 Promotor bla NDM ble MBL trpf Ontstaan van Ec626 samenstelling Deletie van het gebied met ISAba125 en promotor Herstel van de keten Resultaat: Samenstelling zonder promotor Gevoelige stam Bevestiging door meten van de expressie van ble MBL 18

19 Gelijktijdige transcriptie van genen Eiwit 1 Gen 1 Gen 2 Transcriptie mrna Translatie Eiwit 2 Code van 2 genen overschrijven in één mrna gebruik makend van dezelfde -35 en -10 signalen Gencodes in mrna vertalen in 2 eiwitten Carbapenemase bla NDM ble MBL mrna Bleomycine resistentie eiwit 19

20 Bleomycine-gevoeligheid Zeocin (analoog van bleomycine) in papieren disk 25 µg 50 µg 25 µg 50 µg 0 µg 0 µg NDM-PCR+, MIC meropenem >32 NDM-PCR+, MIC meropenem 0.02 Ec626 20

21 Hoe zit het in andere NDM+ stammen Enterobacteriaceae isolaten verzameld in het kader CPE-surveillance Daan Notermans zal hierover meer vertellen Van deze CPE s waren er ca. 20 NDM-positief 21

22 MIC s van NDM+ isolaten Ec626 NDM gene Species MIC mero Enterobacter aerogenes 12 Enterobacter cloacae 2 Escherichia coli 6 Escherichia coli >32 Escherichia coli >32 Klebsiella pneumoniae* 1 Klebsiella pneumoniae* 6 Klebsiella pneumoniae 1.5 Klebsiella pneumoniae 2 Klebsiella pneumoniae* 8 Klebsiella pneumoniae* >32 Klebsiella pneumoniae 16 Klebsiella pneumoniae 24 Klebsiella pneumoniae >32 Klebsiella pneumoniae >32 blandm-5 Escherichia coli* >32 blandm-5 Escherichia coli* 12 blandm-5 Escherichia coli blandm-7 Enterobacter cloacae >32 blandm-7 Klebsiella pneumoniae >32 blandm-7 Klebsiella pneumoniae 2 EUCAST Clinical Breakpoint, valid from Carbapenems MIC breakpoint (mg/l) S R > Doripenem 1 4 Ertapenem Imipenem 2 8 Meropenem 2 8 Veel lage MIC s Hoe zit het met de NDM-genen in deze isolaten? 22

23 NDM-regio in Nederlandse isolaten IS elements ISAba125 Promoter bla NDM ble MBL trpf DM gene Species blandm-5 blandm-5 blandm-5 blandm-7 blandm-7 blandm-7 Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Klebsiella pneumoniae* Klebsiella pneumoniae* Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae* Klebsiella pneumoniae* Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Escherichia coli* Escherichia coli* Escherichia coli Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae ISSpu2 ISAba125 ISEc33 IS5D 23

24 NDM-regio s in Nederlandse isolaten 3 NDM-varianten gevonden NDM-1, het merendeel NDM-5, het bijzondere E. coli isolaat en een andere E. coli Drie NDM-7 isolaten: één E. cloacae en twee K. pneumoniae PLoS ONE 8(4): e61322.doi: /journal.pone Er is geen relatie tussen NDM-variant en MIC 24

25 Isolaten met incompleet blembl gen Twee isolaten met incompleet ble MBL gen 25 µg 50 µg 25 µg 50 µg 1000 µg 100 µg 1000 µg 100 µg 25

26 Conclusies In Ec626 is de promotor geïnactiveerd Toevallige bevinding, onduidelijk of dit vaker voorkomt Drie NDM-varianten gevonden Deze variatie is groter dan verwacht Aanzienlijke variatie in gebied rondom bla NDM gen Verschillende insertie elementen Deleties Andere sequencing-benadering is noodzakelijk Aanzienlijke variatie in MIC s voor meropenem en veel MIC s onder klinisch breekpunt (EUCAST) Onderzoeken wat oorzaak is NDM gene Species MIC mero Klebsiella pneumoniae* 1 Klebsiella pneumoniae* 6 Klebsiella pneumoniae* 8 Klebsiella pneumoniae* >32 blandm-5 Escherichia coli* >32 blandm-5 Escherichia coli* 12 26

27 Stelling Het gebruik van uitsluitend PCR voor de identificatie van carbapenem resistentie kan leiden tot onjuiste behandeling van de patiënt. Voorlopig blijft een fenotypische identificatie nog noodzakelijk. 27