Erasmus MC. Genetische aandoeningen. Ziekten die geheel of gedeeltelijk worden veroorzaakt door veranderingen in ons genetisch materiaal (DNA).

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Erasmus MC. Genetische aandoeningen. Ziekten die geheel of gedeeltelijk worden veroorzaakt door veranderingen in ons genetisch materiaal (DNA)."

Ludo Maas
5 jaren geleden
Aantal bezoeken:

1 Zebravissen; een alternatief diermodel voor de muis? Rob Willemsen Afdeling Klinische Genetica Erasmus MC Erasmus MC Research afdeling Klinische Genetica Identificatie en karakterisatie van ziektegenen, die betrokken zijn bij erfelijke neurologische aandoeningen - fragiele X syndroom - ziekte van Parkinson - ziekte van Alzheimer Genetische aandoeningen Ziekten die geheel of gedeeltelijk worden veroorzaakt door veranderingen in ons genetisch materiaal (DNA). 1

disrupt specific gene express mutant gene Reverse Genetics mice

gene function Nobel prize 2007 Waarom de zebravis?

complex makkelijk in stand te houden; klein en goedkoop korte

transparant genoom (verzameling van alle genen) van de zebravis

2 disrupt specific gene express mutant gene Reverse Genetics mice with abnormalities KO mice KI mice gene responsible transgenic mice gene function Nobel prize 2007 Waarom de zebravis? relatief simpel vertebraat organisme (gewerveld) brein is minder complex makkelijk in stand te houden; klein en goedkoop korte generatie tijd bevruchting is extern (ex-utero) embryos zijn transparant genoom (verzameling van alle genen) van de zebravis bijna compleet veel humane (ziekte)genen ook in zebravis bekend manipuleren van gen expressie mogelijk 2

Development 123:461 made by Brad Smith Genereren van een knockout zebravis ES cellen

3 Zebravis embryogenese Vergelijking embryonale ontwikkeling zebravis-muis 1 dpf 21 dpf Karlstrom RO, Kane DA (1996). A flipbook of zebrafish embryogenesis. Development 123:461 made by Brad Smith Genereren van een knockout zebravis ES cellen zijn beschikbaar - homologe recombinatie mogelijk Geen nakomelingen waarbij gen is uitgeschakeld 3

4 Reverse genetics strategie in zebravissen mutant gen morfolino strategie (knock-down) TILLING (knock-out) abnormaal eiwit of Geen eiwit loss of function (no pluripotent ES cells) gain of function abnormale cel functie cel dood transgene vis ziektebeeld TILLING = Targeting Induced Local Lesions In Genomes Alternatief voor knockout = knockdown organisme orgaan cellen DNA (genen) kern cytoplasma mrna eiwitten Morfolino Morfolino s zijn synthetische oligonucleotide waarmee via antisense technologie genexpressie wordt stilgelegd Morfolino s zijn stabiel en werken tot 90 uur na bevruchting Alternative for KO = knockdown DNA mrna Morpholino proteins Morpholinos are antisense oligonucleotides (25bp) that bind mrnas and prevent translation/splicing via complementary base pairing Morpholinos are very stable and inhibit translation for up to 90 hrs 4

5 Morfolino design voor fxr1 Dr fxr1 GUUCUGGAACUUUACCCAGCAUCCUCUUCGCGCUCAACAUGGAGGAACUGAC 1 st MO 2 nd MO Mismatch Hoe werken morfolinos? AAAAAAA AUG Geen translatie Geen eiwit Morfolinos worden geinjecteerd in 2-cellig stadium van bevruchte eitjes Design splice-blocking MO pro m exon1 intron1exon2intron2exon3 DNA transcription splicing translation = MO mrna Protein Splice-blocking aberrant mrna degradation no protein 5

Reverse genetics Mouse Zebrafish Knock out

Splice mutants Knock down (blocking RNA > no

Verzamelen van bevruchte eitjes Breeding: 1

(<< geleidbaarheid) Licht-donker cyclus 14

6 Reverse genetics Mouse Zebrafish Knock out (inactivating a gene > no transcription) Splice mutants Knock down (blocking RNA > no translation) Bevruchting van zebraviseitjes + Verzamelen van bevruchte eitjes Breeding: 1 vrouwtje + 3 mannen ververs 50% water met RO (<< geleidbaarheid) Licht-donker cyclus 14 hrs licht / 10 hrs donker Licht aan: ± 30 min eitjes 6

7 Verzamelen van bevruchte eitjes MO micro-injectie in bevruchte zebravis eitjes 24 uur na micro-injectie 7

Hart ontwikkeling en fxr1 functie in de zebravis Kromming (looping) van

Gittenberger-de Groot et al. Pediatr Res.

fxr1 MO 70 beats/ min Speed 1/6 Zebravis fmr1 stop mutatie via TILLING

8 Hart ontwikkeling en fxr1 functie in de zebravis Kromming (looping) van het hart: - mens rond dagen - zebravis tussen 1-1,5 dag Gittenberger-de Groot et al. Pediatr Res Hart ontwikkeling (72hpf) na fxr1 MO injection Normal 190 beats/ min fxr1 MO 70 beats/ min Speed 1/6 Zebravis fmr1 stop mutatie via TILLING TILLING = Targeting Induced Local Lesions In Genomes Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 agg cta Cga cct gtg (C>T ) TGA = stop 8

9 Fmrp expressie in brein van de zebravis cerebellum telencephalon WT Fmr1 KO Zebravissen en gedragstesten Leren en geheugen (Morris water maze) TRIAL 1 (swim 1) length: 2203 cm latency: 93 s TRIAL 4 (swim 1) length: 674 cm latency: 27 s TRIAL 12 (swim 1) length: 104 cm latency: 4 s T-maze gedragstest (leren/geheugen) 9

Zebravissen en de ziekte van Parkinson Ziekte van

Symptomen: beven, spierstijfheid, bewegingstraagheid

Parkinson-gen LRRK2 transgene zebravis Zebravissen

locomotor activiteit ethovision 300 20 weeks 52

10 Zebravissen en de ziekte van Parkinson Ziekte van Parkinson: afsterven van dopaminerge neuronen Symptomen: beven, spierstijfheid, bewegingstraagheid + MPTP 6-OHDA Parkinsonachtig fenotype Alternatief: Parkinson-gen LRRK2 transgene zebravis Zebravissen en de ziekte van Parkinson Brein-specifieke promoter GATA-2 prom. met GFP reporter 1 dpf 3 dpf Zebravissen en locomotor activiteit ethovision weeks 52 weeks 72 weeks time spent on rod 50 CGG repeat WT 0 t1 t2 t3 t4 t1 t2 t3 t4 t1 t2 t3 t4 Diazepam WT 10

11 Zebravissen en locomotor activiteit Zebravissen en locomotor activiteit 2x playback speed, detection by Ethovision Zebravissen en drug discovery assays number of different drugs quantity ~ 1mg ~ mgs > grams 11

is a complementary animal model to mouse models pre-selection tool in mouse KO studies Verfijning 3 V s zebravis lager

12 Conclusions - zebrafish is an alternative animal model to mouse models gene function studies during embryonic development high throughput analysis in drug discovery (in vivo studies) modelling human disease (both embryonic and adult) - zebrafish is a complementary animal model to mouse models pre-selection tool in mouse KO studies Verfijning 3 V s zebravis lager organisme (minder aaibaar) Vermindering minder dieren Vervanging Tot 5dpf geen proefdier volgens wet op preofdieren Toekomst? 12

13 Zebravis faciliteit Erasmus MC Acknowledgements Sandra van t Padje Bill Chaudhry (UK) Staff EDC Ben Oostra Herma van der Linde Lies-anne Severijnen Wiebren Hasselaar Rene Ketting (Hubrecht lab) Vragen? 13

14 Zebravis workshop Rotterdam Woensdag 23 januari huisvesting/ onderhoud/kwaliteitscontrole - micro-injectie/mo design - gedragstesten (locomotor en T-maze) - microscopie en beeldverwerking Deelname gratis. Beperkt aantal deelnemenrs (max 10 personen Aanmelden: r.willemsen@erasmusmc.nl 14

Vergelijkbare documenten

De rol van immuun cellen in de ziekte van Alzheimer

De rol van immuun cellen in de ziekte van Alzheimer Tjakko van Ham Klinische Genetica, Erasmus MC, Rotterdam t.vanham@erasmusmc.nl Microglia, immuun cellen van het brein Wat weten we wel & wat weten we